问题

可能原因

验证或解决办法

无染色

一抗和二抗不匹配

使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）

没有足够的一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体。延长4℃孵育时间（如过夜）。

抗体的天然结构（3D形态）受损不适用于IHC

用天然（非变性的）WB法检测抗体，确保抗体没被损坏。

由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照。

组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作。

没有避光保存二抗

避免将二抗处于光照下

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯。

固定步骤（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）修饰了抗体识别表位

抗原修复法暴露出抗原表位，缩短固定时间。

蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜

在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根

在抗体PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物，或使用新鲜无菌的PBS。

高背景

没有封闭非特异性结合或封闭不充分

延长封闭时间，并考虑改换封闭剂。建议用10%正常血清封闭切片1小时或1-5% BSA封闭培养细胞30分钟。

一抗浓度过高

滴定法寻找到最佳抗体浓度，或在浓度较低抗体中延长孵育时间（最好是缓慢而准确地结合）。

孵育温度过高

4°C孵育切片或细胞。

二抗发生了非特异性结合（被损坏）

不加一抗，做二抗对照。

组织冲洗不彻底，有固定剂残留

所有步骤都要用PBS充分洗涤。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM)，或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

固定过度（固定剂用福尔马林和多聚甲醛）导致抗体识别抗原位点被修饰

改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间。

信号过度放大（信号放大技术）

缩短信号放大孵育时间，稀释信号扩大试剂盒。

染料与PBS在细胞/组织中相互作用（酶检测法）

用Tris缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。孵育后，Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片。

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂

底物过量（酶检测法）

缩短底物孵育时间

非特异性染色

一抗/二抗浓度过高

降低抗体浓度和或缩短孵育周期。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑(2mM)，或抑制过氧化物酶的H2O2(0.3% v/v)。

一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织)，加二抗后，二抗会与同源的所有组织结合

应用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度，切勿变干。