WB的常见疑问及解答

发布者：信息部    发布时间：2015-05-06

1、为什么实际的蛋白质印迹条带大小与预期的不同？

蛋白质印迹是根据大小分离蛋白质的技术。通常，分子量越小的蛋白质在凝胶中的迁移速率越快。但是迁移速率也受其他因素影响，因此观察到的实际条带大小与预期的可能会有差别。

常见因素包括：

翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量。

翻译后剪切 - 例如，很多蛋白质首先合成为前体蛋白，然后剪切形成活性形式，例如半胱天冬酶前体

剪接变体 - 通过选择性剪接，可实现同一基因产生不同大小的蛋白质

相对电荷 -氨基酸的组成（带电荷的氨基酸与未带电荷的氨基酸各自所占的比例）

多聚体 - 例如，蛋白质二聚体。蛋白之间强烈的相互作用会造成条带偏大，但采用还原条件通常可以避免多聚体的形成。

2、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜不是很好？

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，如果延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的一端可能就会变淡。

3、大蛋白和小蛋白转膜时要注意哪些？

对于大蛋白（大于100kDa）而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心；SDS阻止蛋白与膜的结合，小蛋白更是如此。因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可不加SDS，同时保持20%的甲醇浓度。

4、western blot 使用的膜哪种好，PVDF好还是NC膜，如何选择？

PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。

5、western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？

一般来说单抗的特异性好，杂带少；多抗相对单抗易出条带，但特异性较差，可能会出现高背景和多带现象。

6、制备蛋白样品时，应选择哪种裂解缓冲液来释放目的蛋白？

裂解缓冲液有很多种，但用来做WB实验的仅有少数几种，简单来说，它们溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。

Admin